IPS诱导肠类器官的培养流程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化以及中/后肠模式化的诱导，最后是类器官的培养。本文将重点介绍第三个阶段——类器官的培养，具体操作过程如下。

一、准备工作

所需试剂和耗材包括：人正常肠类器官培养试剂盒 (abs9545)、低因子无酚红基质胶 (abs9495)、15ml离心管 (abs7102)、多个15ml EP管 (abs7119)、24孔细胞培养板 (abs7035)及金属冰盒。具体组分和规格如下：

• 类器官培养基 A - 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B - 250ml
• 类器官传代消化液 D - 30ml
• 组织保存液 E - 100ml
• 类器官冻存液 F - 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G - 250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

（1）准备工作：基质胶需在金属冰盒中于4℃冰箱中融化过夜；枪头及离心管需在-20℃提前预冷至少半小时；融化后的基质胶建议在2周内使用完毕。

（2）接种：在24孔板每孔中加入25μl基质胶混合物，500-750μl类器官培养基。

（3）接种密度：建议基质胶与球状体的体积比为25:1；对于计数接种，建议每25μl基质胶中加入约50个球状体。

（4）加胶-点板：将基质胶加入细胞团沉淀中，轻轻吹打混匀后进行点板。全程需在金属冰盒或冰上进行以保持基质胶的流动性，确保控制在半分钟内完成每一步。

（5）待培养：将铺好的培养板置于37℃培养箱中，等待40-60分钟使其成胶，再添加500-750μl类器官培养基，约10-14天后可进行传代操作。

2. 传代（土胎被分为两种情况）

（1）类器官数量众多时，先进行收集和洗涤步骤。

（2）若类器官数量不足，按照相应步骤进行收集和洗涤，确保基质胶被充分稀释并易于去除。

3. 冻存

类器官在指数生长期进行冻存。需在第3-4天时进行冻存，确保类器官直径在100-200μm。收集类器官后，按密度要求添加冻存液，随后进行梯度冻存，确保最大程度保存类器官活性。

复苏过程

在进行类器官复苏前，需要准备37℃的水浴锅。解冻时务必迅速并轻柔进行。完成解冻后，添加类器官传代培养缓冲液进行重悬并进行相应离心处理。成功复苏后，需要重新接种培养，期间应注意基质胶的添加和细胞团的分散。

关键注意事项

确保在操作过程中实施无菌技术，持续检测以避免污染。此外，使用新鲜配制的生长因子以保证其活性，同时注意密度控制，以确保类器官的成功培养。

通过严格遵守以上流程，结合918博天堂的优质试剂和设备，可以高效生成功能性的人类肠道类器官，广泛用于疾病建模和药物筛选等研究领域。若您在实验过程中遇到任何问题，欢迎与我们进行交流，918博天堂竭诚为您提供支持！