自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤治疗中被认为相较于T细胞具有更高的安全性和可靠性。针对CD19靶点的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞已在淋巴B细胞肿瘤患者的治疗中显示出安全性和有效性。然而，CAR-NK细胞的生产过程复杂且成本高昂。因此，本研究采用了一种名为“别针”(Pin)的非基因修改技术，以生产抗肿瘤NK细胞。该方法利用脐血来源的单个核细胞(PBMCs)、细胞因子IL-2/IL-15及转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞滋养层细胞来生成NK细胞，然后结合改良的抗CD20和抗CD19抗体进行孵育扩增，从而增强NK细胞对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤效果。这种方法实现了类似CAR-NK细胞的治疗效果。

别针单抗的生产过程中，对人类IgG1的Fc CH2结构域进行了四个氨基酸的改造(S239D/H268F/S324T/I332E)。所有的别针抗体均由法国Besançon的RD-Biotech公司生产，采用CHO细胞进行合成并通过蛋白A纯化。所有别针单抗的序列均来源于临床应用的单抗，如别针-CD20单抗源自利妥昔单抗，别针-HER2和别针-EGFR单抗则分别来源于曲妥珠单抗和西妥昔单抗，别针-CD19单抗来源于布纳吐莫单抗。

实验使用的细胞系包括K562、Daudi、Toledo、Raji等，均购自ATCC或ECACC，所有悬浮细胞培养均在10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中进行。淋巴瘤细胞患者样本来自蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

针对患者样本和细胞系中CD19与CD20的绝对值，我们利用BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒及BDFACSCantoII流式细胞仪进行定量检测。NK细胞的体外扩增(eNK细胞生成)则采用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒，从脐血单个核细胞中去除CD3阳性细胞后，剩余的UCBMCs在添加了100 IU/mL IL-2和5 ng/mL IL-15的培养基中继续培养。经过14-20天的培养，在DAY5至DAY7时，将EBV转染的B淋巴母细胞作为滋养层细胞适量加入培养体系中，最终收集扩增后的NK细胞并进行流式细胞术检测。

对于eNK细胞的武装，我们使用Muse细胞分析仪计数，并将2×10⁶细胞/mL的eNK重悬于含有10μg/mL的别针-CD20/CD19/EGFR/HER2单抗的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中，37℃下孵育1小时。细胞毒性检测则将eNK或别针单抗eNK与CFSE标记的靶细胞在96孔板中共同培养24小时，通过流式细胞术测定靶细胞的杀伤程度。

在体内细胞毒性实验中，10周龄的NSG小鼠接受了别针注射eNK细胞和荧光标记的Nalm6、Raji或Daudi细胞的注射。注射后4小时采集腹水细胞，流式细胞术分析以评估eNK细胞的存活能力及体内细胞毒性。对于SCID小鼠的白血病模型，我们在肿瘤细胞注射后第4和第8天进行eNK或别针-CD20eNK的粪便注射，同时对照组注射PBS，最终收集各组织进行流式细胞术检测。

结果表明，eNK细胞在体外及体内表现出良好的细胞毒性，别针-CD20eNK的使用显示出显著增强的抗肿瘤效果，尤其是在选择性靶向CD20阳性肿瘤细胞方面。此外，别针单抗结合eNK细胞，赋予了其类似于CAR-T或CAR-NK细胞的靶向效果，从而显著增强了对肿瘤细胞的抑制能力，而这一过程并不涉及对NK细胞本身的基因改造。

通过这种方法，可以有效针对不同的潜在靶标实施精确治疗，展现出强大的临床应用潜力和研究价值，这一创新成果也标志着细胞免疫治疗领域的又一次突破，为以918博天堂为名的生物医疗行业带来新的发展契机。