IPS诱导肠类器官培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：
（1）将hPSCMediumSupplement在2-8℃下解冻，融化后轻轻摇动均匀，按需要分装后立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融；
（2）按照1:50的比例，将10mL的hPSCMediumSupplement加入到500mL的hPSCMediumBasalMedium中，混匀后即得人多能干细胞培养基（abs9403）。应注意的是，混合后的细胞培养基可在2-8℃下稳定保存2-3周，超过3周的培养基不建议使用；
（3）实验试剂的平衡：人多能干细胞培养基在实验前放置于室温避光平衡，而PBS和消化液等需加热至37℃。要注意，培养基中含有因子，不要在37℃水浴中加热。

二、操作方法

(以下操作步骤均需在无菌条件下进行)
1. hPSC细胞复苏：
（1）基质胶包被培养板：取出6孔板或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL基质胶（abs9410），轻轻晃动使基质胶完全覆盖底部，置于37℃培养箱中孵育1~2小时。实验前取出并在超净工作台或生物安全柜中室温下平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，但需在1周内使用。
（2）取2~3mL的人多能干细胞培养基放入15mL离心管中备用。
（3）解冻：将冻存管快速浸泡在37℃温水中，快速摇动以在1~2分钟内完成解冻，尽量减少细胞在室温下的暴露时间。
（4）离心：将解冻后的冻存液逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，置于低速离心机内平衡后以1000rpm离心3分钟。
（5）重悬：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基对干细胞沉淀轻轻吹吸混匀，约3~5次。
（6）接种：将已混匀的干细胞悬液加入已包被的6孔板中，每孔补齐至2mL培养体系。
（7）培养：接种后的6孔板可用倒置显微镜观察细胞密度及细胞团块大小，理想情况为4个细胞以上的团块。轻轻晃动板子使细胞均匀分布，并在37℃、5% CO2的恒温培养箱内培养，第二天观察细胞贴壁情况。
（8）换液：从复苏开始每24小时换液一次，培养基中的活性成分仅能维持一天，需及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）集落

2. hPSC细胞传代：
（1）清洗：吸掉原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液；
（2）消化：在6孔板中加入2mL/孔的人多能干细胞消化液（abs9409），使其覆盖皿底，并在37℃培养箱中放置2~5分钟，消化时间可根据细胞生长密度进行调整；
（3）吹打：吸掉消化液后，加入2mL培养基并用移液枪轻柔吹打皿底，使干细胞集落脱落，转移至15mL离心管中；
（4）离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清；
（5）接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5~10次，去除包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，最终补齐至2mL培养体系；
（6）换液：从传代开始每24小时换液一次，确保培养基的活性成分始终充足。

多能干细胞（PSCs）集落染色图

3. hPSC细胞冻存：
（1）清洗、消化、吹打、离心步骤同前述；
（2）重悬：弃去上清，加入2mL的ES/iPS细胞冻存液（abs9412）对干细胞沉淀进行轻柔混匀，随后转移至冻存管中；
（3）记录：在冻存管上标记细胞种类、冻存时间、操作者及细胞批次；
（4）-80℃冰箱冻存：将冻存管置于-80℃冰箱中过夜。务必保持冻存管直立放置；
（5）液氮冻存：24小时后，将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

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